DNA测序原理

日期:22022-08-15/ 人气: / 来源:网络

简介

经过13年的国际合作,2003年完成了人类基因组测序,投入了30亿美元。尽管桑格测序在人类基因组计划中得到了大量的优化,但它是20世纪70年代发明的DNA测序的主要方法。

如今,对用于测序的需求以几何级数增长,而需要大量的基因组DNA进行快速分析则是廉价且精确的。感谢统称为下一代测序的新测序技术,现在可以在数小时内对整个人类基因组进行测序。

桑格序列测定及新一代测定。

下一代测序(NGS)的原理与Sanger测序相似,它依靠毛细管电泳。当基因片段的碱基被发射出信号来识别时,基因片段就被模板链连接起来。

在测序、分离(通过电泳)和检测Sanger法等方面都需要独立的步骤,这使其很难自动进行样品制备,且存在通量过大、扩展性和分辨率限制。这种NGS方法利用组合Sanger测序开发的方法,能解决百万反应并行问题,且速度极高,可采用成本较低的技术进行阵列测序。许多年过去了,桑格方法的基因组测序项目,现在可以在NGS的时间内完成,尽管阅读时间更长(即时间序列碱基),精确度更低。

新一代DNA测序方法包括三个基本步骤:

基因库准备:基因库是利用DNA的随机片段生成,然后通过定制连接连接起来。

•放大:这个类库采用了克隆放大和PCR放大两种方法。

测序:DNA是用几种不同的方法中的一种来测序的。

库的准备

第一,DNA由两种酶或通过超声波(用超声波激发)来产生较小的线段。接配器(合成DNA的短双链部分)与这些片段相连,并利用DNA连接酶的作用,连接DNA链上的一种酶。适配器将序列组合成补充配对。

将适配器合成,使一端为“粘性”,另一端为‘钝’(非粘性),以便在钝端加入DNA。这样就会产生分子,从而产生二聚体之间碱基配对的潜在问题。为防止这种情况发生,在3'-OH5'-P的末端连接时,使用DNA的化学结构。DNA连接酶不能通过从适配器的粘性末端移除磷酸盐而形成5'-OH末端,从而形成末端之间的桥梁(1)

1|新一代测序库的制作

要成功进行序列测定,文库片段需要在PCR菌落中进行,或者“polonies”,因为它们是公开的,包含了在空间中大量的特定文库片段的集合。因为这些polonies是以一种平面方式连接的,所以该阵列的特性可以酶促并行操作。与菌落采集和大肠杆菌克隆技术相比,文库构建的这种分离和扩增DNA的方法可以大大加快Sanger测序早期劳动密集型过程的速度,但代价是牺牲了片段长度。

扩大。

需要进行文库扩展,以便从音序接收到的信号足够强,能够进行精确检测。通过酶扩增,会出现文库中某些片段优先扩增的现象,如“偏移”和“复制”。与此相反,PCR用于生成大量DNA簇的扩增过程有多种类型。

胶乳PCR

胶乳油、胶珠、PCR混合物和文库DNA混合形成微孔(如图2所示)

乳液型PCR法。

为使测序过程顺利进行,每一个微井都应该有一个胎圈和DNA(其中大约15%是这组化合物)。对PCR后变性的文库片段进行了两个独立的链的研究,其中一个(反向链)退火到颗粒。经聚合酶处理的退火DNA开始扩增,指向引物部位。原来的反链随后发生变性,从胎圈仅重新退火释放出珠子,得到两条独立的链。通过扩增,获得附着在胎圈上的两条DNA链。然后在30-60个循环过程中产生DNA簇重复。这项技术被批评为一种耗费时间的技术,因为它需要许多步骤(成型和破乳,PCR扩增,浓缩等),尽管它在许多NGS平台上得到了广泛应用。这种方法的效率也相对较低,因为仅有2/3的乳化微反应器实际上只有一个微珠。所以,额外的一步是必需的空系统,这会导致潜在的不精确分离。

PCR大桥。

流水池的表面被密集地包覆了一对DNA文库片段(引物互补性如图3)DNA随后被连接到随机细胞的表面,在那里,它被用来根据聚合酶的伸长而接触试剂。当添加了核苷酸和酶时,DNA的单链的自由端连接到通过互补引物的细胞表面,从而形成桥接结构。然后通过桥梁相互作用,使酶产生双链,这样,当变性发生时,两个单链DNA片段就在接近的表面相连。这个过程的重复会产生局部相同的克隆簇。要优化群集密度,必须对试剂浓度进行严密监控,避免过度拥挤。

桥接PCR法的应用。

定序

多家公司已经开发出几种新一代测序竞争方法。

焦磷酸序列测定法

焦磷酸测序是基于“测序通过合成”的原则,在聚合酶存在下由互补链合成的图4。取而代之的是,使用双脱氧核苷酸终止链的扩展(如在Sanger序列中),用焦磷酸序列来替代检测DNA链中的焦磷酸添加释放的方法。该公司最初使用乳液型PCR技术构建测序所需的polonies,并去除互补链。然后,将单链DNA的测序引物杂交到链(引物接合区)的末端,用四种不同的dNTP分别制成polonies流和流流带。将合适的dNTP加入酶的链中,可导致焦磷酸盐的释放。焦磷酸在ATP硫酸和腺苷存在下转化为ATP。这种ATP分子被用来在荧光素酶的催化下转化成氧化的萤光素,它产生的光可以用摄像机检测到。光照的相对强度与所加碱的量成正比(即强度双倍峰值表明同一碱基的两次递增)

4|454焦磷酸序列分析。

454生命科学公司开发的焦磷酸测序技术是新一代测序技术的早期成果之一;事实上,454生命科学公司制造的第一个商业化的下一代音序器。但是,其他技术也对此方法产生了影响,新所有者罗氏公司于2013年宣布关闭454生命科学公司,454焦磷酸测序平台停产。

离子激流半导体序列测定

离子流测序采用“测序通过合成”的方法,即在同一时间内,新的DNA链与目标链互补,合成一个碱基。半导体芯片检测到DNA聚合(在聚合过程中生成氢离子图5)

下面是乳化PCR聚合酶群落形成的过程,DNA文库片段依次填充了每一个三磷酸核苷(dNTP),如焦磷酸序列。将dNTP与新链如果互补的靶链的核苷酸混合。每一次成功地增加了核苷酸,氢离子就会释放出来,并由pH传感器检测到。例如在焦磷酸序列测定法中,如果加入一个以上的同一核苷酸,在pH/信号强度上就会有较大变化。

5|离子激流半导体序列测定

该离子流测序是首项商业化技术,没有使用荧光和照相机扫描,因此比其他方法更快、更便宜。遗憾的是,要枚举一个连续的相同碱基加成可能很困难。举例来说,很难将pH改变为长度9homorepeat长度10中的一个,这使得重复解码变得困难。

联接顺序测定(固态)

固态序列测定法,利用DNA连接酶,在生物技术中广泛应用于连接DNA双链的能力(如图6所示)。用乳化PCR方法,将固定/放大的已上珠与目标序列结合(即序列待测序),形成单链DNA引物结合区(称为适配器)。这些珠粒随后沉积在玻璃表面,形成球状。


作者:小编


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